利用超臨界流體色譜技術對甲霜靈對映體進行分離及純化
來源：沃特世公司 發布時間：2015-12-09
農藥公司對于殺蟲劑單一對映體的功效極為關注。然而，要研究單一異構體的作用，首先必須分離對映體。必要的制備分離技術對于我們研究手性殺蟲劑單一異構體的立體選擇性來說至關重要，因為我們需要采用這些技術來分離得到單一的立體異構體。
雖然傳統的分離方法主要采用液相色譜(LC)，但是近年來人們也逐漸開始采用超臨界流體色譜(SFC)來代替正相LC，將手性純化從半制備級別放大至千克級。由于超臨界流體具有高擴散性和低粘度，SFC可實現比正相HPLC快3-8倍的分離速度，從而顯著提升工作效率。與正相LC相比，SFC還具有獨特的選擇性，有機溶劑消耗量更少、廢液產生量更低、采集體積更小以及純化后干燥時間更短等優點。因此總的來說，SFC是一種更加經濟高效且環境友好的制備型色譜技術。SFC純化方法開發的第一步是開發優化固定相和流動相的分析方法。采用Waters ACQUITY UPC²系統可快速完成該步驟，接下來即可使用Investigator SFC系統對開發的方進行放大，用于后續的制備純化。
面對嚴格的任務期限和預算限制，農藥公司研發和推出新產品的壓力與日劇增，這一結合了SFC技術優勢的全新工作流程無疑是理想之選。甲霜靈是一種苯基酰胺類殺菌劑，其化學結構中有一個手性中心(圖1)，它的殺菌活性主要來自于R對映體。在此應用紀要中，我們采用ACQUITY UPC²系統對甲霜靈進行手性分離，然后采用Investigator SFC系統將該方法放大為半制備級別的純化。
圖1. 甲霜靈對映異構體的結構。星號代表立體中心。
實驗方法
儀器
在配備PDA檢測器的ACQUITY UPC²系統上采用215 nm的波長進行分析，在Investigator SFC系統上進行半制備純化。系統組成如下：流體輸送模塊(FDM)、自動反壓調節器(ABPR)、Alias自動進樣器、10端口Analytical-2-Prep柱溫箱、2998 PDA檢測器、補充泵、六位餾分收集模塊。此系統由ChromScope軟件控制。
樣品制備
外消旋(R, S)-甲霜靈標準品購自Sigma-Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)。用甲醇分別配制1 mg/mL和20 mg/mL的標準品溶液用于分析進樣和制備進樣。
分析色譜法
分析分離采用Chiralpak IA-3(4.6 x 150 mm, 3 µm)色譜柱。
結果與討論
SFC純化的第一步通常是對多個手性固定相和流動相進行梯度篩選。確定了對樣品對映選擇性最高的色譜柱條件和溶劑條件之后，需要將梯度方法轉換為等度分離法。ACQUITY UPC²系統具有多色譜柱切換功能，提供四種共溶劑選擇。采用這種技術可縮短分析時間，從而快速完成方法開發過程。采用IA-3色譜柱分離對映體獲得了最高的分離度(圖2)。因此我們選擇了該色譜柱來進行后續的實驗。
圖2. 采用IA-3色譜柱的UPC² PDA提取波長色譜圖(215 nm)。
為了在制備型SFC上進行重迭進樣以提高分析效率，我們必須采用等度分離條件。開發適當的等度方法時，我們需要認真考慮分離度和運行時間這兩個會影響總體分析效率且互為競爭關系的因素。一般來說，共溶劑百分比越大，運行時間越短，但分離度也越低。此外，大體積進樣也會影響制備色譜法的分離度。要建立成功的等度方法，我們往往需要通過實驗確定合適的運行時間與分離度，使二者達到平衡。對于本實驗，含4%共溶劑的等度洗脫液更適合分析級分析。
放大
分析級分析與半制備級分析的參數差異主要來自于所用色譜柱顆粒的粒徑不同(3 μm和5 μm)，以及所用系統(UPC²和Investigator系統)的系統體積不同。我們根據這些差異對運行參數進行了相應調整，從而確定合適的分離度、上樣量以及運行次數。
我們采用10-mm I.D. x 150 mm的IA色譜柱進行了上樣量研究，以確定制備分析運行的最大上樣量，實驗結果如圖3所示。我們采用的進樣體積為20 µL、40 µL和80 µL。上樣體積為80 µL時，甲霜靈對映體仍能獲得良好的分離效果。因此，該方法的單次最大有效上樣量為80 µL或1.60 mg(換算為質量)。
圖3. (R, S)-甲霜靈的SFC色譜圖，采用10-mm I.D.IA色譜柱，進樣體積分別為20 µL、40 µL和80 µL，樣品濃度為20 mg/mL。
重迭進樣能夠在不影響色譜效率的前提下提高分析效率。圖4展示了(R, S)-甲霜靈(20 mg/mL)五次重迭進樣的SFC色譜圖，每次進樣80 L濃度為20 mg/mL的外消旋溶液。五次重迭進樣共耗時20分鐘，純化得到了8 mg對映體(每種對映體4 mg)。溶劑總用量為20 min x 8% x12 mL/min = 約19 mL。由于色譜分析條件為等度條件，我們在前一次進樣的色譜分析尚未完全結束時即進行下一次進樣，這樣就使得前一次進樣的最后一個峰與隨后進樣洗脫出的第一個峰鄰近。此外，大體積進樣也會影響制備色譜法的分離度。通過上述連續進樣法所得的色譜圖中，色譜峰排布緊湊，充分說明該方法能夠極大節省分析時間和溶劑。ChromScope軟件可對進樣和收集間隔進行管理，從而有效地預測和收集餾分。
圖4. (R, S)-甲霜靈樣品五次重迭進樣的SFC色譜圖。陰影區域代表收集到的餾分，紅色三角形是進樣標記。
我們采用UPC²等度分析法分析收集到的兩種餾分，以確認樣品純化結果，所得的色譜圖如圖5所示。兩種餾分的純度均>99%。然后采用市售甲霜靈-M((R)異構體)標準品來確認其絕對構型。
圖5. 所收集餾分的分析級SFC色譜圖，對映體純度>99%。
結論
我們將外消旋甲霜靈作為模型化合物，采用Investigator SFC系統對其進行了分析，實驗結果表明，該系統可實現單個平臺上的手性分離和純化，是應對此類分析挑戰的強大分析工具。采用ACQUITY UPC²系統進行的手性篩選可快速確定用于分離R-和S-甲霜靈的最佳色譜柱。此外，我們還開發出了一種等度方法充分發揮重迭進樣的優勢，且該方法還能在維持分離度，保持合理運行次數以及最大上樣量等合理原則的前提下輕松進行放大。采用SFC技術的重迭進樣可實現24 mg/h的純化效率，獲得高純度的甲霜靈對映體餾分，而其有機溶劑消耗量遠低于傳統LC純化的有機溶劑消耗量。采用更長的重迭進樣系列還可獲得更多的純化產物。通過結合UPC²與Investigator SFC系統，我們成功驗證了將SFC應用于手性篩選、方法開發、放大以及采用重迭進樣的小規模純化制備時的完整工作流程，可完全滿足人們日益增長的快速手性分離需求。該工作流程溶劑消耗量更少、干燥時間更短，可顯著提高實驗室分析通量，同時降低單個樣品的處理成本。