使用ACQUITY UPC2超高效合相色譜快速分離營養保健品中的維生素K1異構體和維生素K2
來源：沃特世公司 發布時間：2015-12-09
天然產物中的維生素K1（葉綠醌）主要以反式結構存在，而膳食補充劑通常使用合成的維生素K1，其中可能含有相當數量的順式結構。反式維生素K1具有生物活性，而順式K1并不具備。目前用于分離維生素K1異構體的HPLC方法需要使用C30色譜柱。HPLC方法的典型運行時間大約為20 min，并且有些方法還需要使用氯化溶劑。
超高效合相色譜（UltraPerformance Convergence Chromatography，UPC²）是一種分離技術，它利用壓縮CO2處于或接近超臨界狀態時的特有屬性（即低粘度和高擴散性）以及亞2 μm顆粒填充色譜柱，顯著提高了分離效率、速度和選擇性。
本應用紀要介紹了一種快速分離維生素K1反式和順式異構體以及四烯甲萘醌（MK-4，維生素K2的一種常見形式）的方法，該方法使用UPC²和ACQUITY UPC² HSS C18SB色譜柱，在3 min內即可完成分離。維生素K1異構體和MK-4的結構如圖1所示。與目前所使用的基于LC的維生素K1反式和順式異構體分析方法比相比，此UPC²方法更加快速、簡單（無需使用C30色譜柱），并且所消耗的有機溶劑更少。
使用UPC²和單個UPC² HSS C18SB色譜柱（3.0×100 mm，1.8 μm）在3 min內實現了維生素K1順式和反式異構體以及MK-4的基線分離。如圖2所示，順式結構的維生素K1首先被洗脫，接著是反式結構，最后是MK-4。關鍵對（順式和反式維生素K1）之間的USP分離度為1.7（表1）。在梯度程序中，在0.5% B中初始2 min的等度洗脫對于順式和反式維生素K1的基線分離是非常必要的。將流動相B的輸送體積精確控制在0.5%對于關鍵對的分離至關重要。ACQUITY UPC²系統是目前市場上唯一能夠提供這種水平的精確控制的SFC系統。等度保持階段之后，本研究采用了流動相B從0.5%增加至20%的通用梯度。此梯度范圍可在應用中根據實際的目標維生素K2同系物的保留時間作出相應的修改。
圖2. 維生素K1異構體和MK-4混合標準品的疊加色譜圖（n = 10）。
本研究還涉及MK-4，因為它是維生素K2的一種常見形式，并且是與維生素K1結構最相近的一種維生素K2。其它形式的維生素K2（如MK-7）具有較長的側鏈，在色譜柱上的保留時間更長。因此它們能夠很容易地與維生素K1分離。總運行時間為4 min，比使用C30色譜柱的HPLC方法的典型運行時間至少快五倍。每一次進樣的有機溶劑消耗量少于1 mL，這只是使用LC方法時典型溶劑用量（15至30 mL）的一小部分。
表1. 維生素K混合標準品的重復分析結果（n = 10）。
混合標準品的十次重復分析表現出優異的重復性（表1）。信噪比為10時，順式維生素K1、反式維生素K1和MK-4的定量限（LOQ）分別為0.06、0.06和0.04 μg/mL（表2）。這些化合物都獲得了良好的線性（R2 >0.998）（表2）。市售維生素K補充劑的分析也表現出良好的重復性和分離度（圖3）。經測定，在這種產品中，順式K1占總維生素K1的11.2%（表3）。
表2. LOQ和線性。
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圖3. 維生素K片劑重復分析的疊加色譜圖（n = 3）。
表3. 維生素K補充片劑的重復分析結果（n = 3）。
利用UPC²技術，可在3 min內使用ACQUITY UPC² HSS C18SB色譜柱快速分離順式和反式維生素1異構體及MK-4。分析速度比目前所使用的HPLC方法快至少五倍，并且無需使用特殊的C30色譜柱。此UPC²方法具有出色的分離選擇性、分離度、靈敏度和重復性，而且所使用的溶劑遠遠少于HPLC方法。UPC²可以用于食品成分檢測實驗室的常規維生素K分析，它能提高實驗室通量、降低運行成本。